A biológiában fontos kérdés, hogy a genomok hogyan szerveződnek a sejteken belül, és hogyan befolyásolja a genom 3D-s architektúrája a sejtfunkciókat. A baktériumok genomi DNS-e a sejtek belsejében erősen kondenzált és funkcionálisan szervezett formában található, az úgynevezett nukleoid (mag-szerű szerkezet, maghártya nélkül). Az Escherichia coli kromoszóma vagy nukleoid a genomi DNS-ből, az RNS-ből és a fehérjéből áll. A nukleoid egyetlen kromoszomális DNS kondenzációjával és funkcionális elrendezésével képződik kromoszómális építészeti fehérjék és RNS-molekulák, valamint DNS-szuperkeresztés segítségével. Bár egy bakteriális nukleoid nagy felbontású szerkezete még várat magára, öt évtizedes kutatás az E. coli nukleoid alábbiakban részletezett jellemzőit állapította meg: 1) A kromoszomális DNS átlagosan egy negatívan szupertekercselt molekula, amely plektonémiás hurkokként van összehajtva, és amelyek a szuperhengeres diffúziós akadályok miatt sok független topológiai doménbe szorulnak; 2) A hurkok térben megabázis méretű régiókba szerveződnek, úgynevezett makrodomének, amelyeket az azonos makrodoménen belüli DNS-helyek közötti gyakoribb fizikai interakciók határoznak meg, mint a különböző makrodomének; 3) A kondenzált és térben szervezett DNS a sejtben sugárirányban elzárt spirál alakú ellipszoid formájában van; és 4) Úgy tűnik, hogy a kromoszómában lévő DNS állapotfüggő 3-D szerkezettel rendelkezik, amely kapcsolódik a génexpresszióhoz, így a nukleoid architektúra és a gén transzkripció szorosan kölcsönösen függ egymástól, kölcsönösen befolyásolják egymást. A nagy felbontású mikroszkópia jelenlegi képviselői,
Escherichia-coli
Ugrás: Bevezetés
Sok baktériumban a kromoszóma egyetlen kovalensen zárt (kör alakú) kettős szálú DNS-molekula, amely a genetikai információt haploid formában kódolja. A DNS mérete 500 000-től több millió bázispárig terjed (bp), amelyek 500-tól több ezer gént kódolnak, a szervezettől függően. A kromoszomális DNS erősen kondenzált, szervezett formában van jelen, amelyet nukleoidnak (mag-szerűnek) neveznek, amelyet nem maghártya zár be, mint az eukarióta sejtekben. Az izolált nukleoid 80% DNS-t, 10% fehérjét és 10% RNS-t tartalmaz [1, 2]. Ebben a kiállításban áttekintjük jelenlegi ismereteinket arról, hogy (i) hogyan válik a kromoszomális DNS nukleoiddá, (ii) az abban szerepet játszó tényezőkről, (iii) mi ismert a szerkezetéről és (iv) hogyan befolyásolják a DNS egyes szerkezeti vonatkozásai gén expresszió, gramm-negatív Escherichia coli baktériumot használunk modell rendszerként. Kiemelünk néhány kapcsolódó kérdést is, amelyeket meg kell oldani. Ez a kiállítás a témával kapcsolatos korábbi áttekintések kiterjesztése [3, 4].
A nukleoidképződésnek két lényeges aspektusa van; egy nagy DNS kondenzációja kis sejttérbe és a DNS funkcionális szervezete háromdimenziós formában [5, 6]. A haploid körkörös kromoszóma az E. coliban ~ 4,6×106 bp. Ha a DNS B formában ellazul, akkor annak kerülete ~ 1,5 milliméter (0,332 nm x 4,6 x 106) (1A. Ábra).
Azonban egy nagy DNS-molekula, mint például az E. coli kromoszóma-DNS, nem marad egyenes merev molekula a szuszpenzióban. A Brown-mozgás görbületet és görbületeket generál a DNS-ben. A maximális hosszúság, amelyig egy kettős spirális DNS egyenes marad, ellenállva a Brown-mozgás által végrehajtott hajlításnak, ~ 50 nm vagy 150 bp, amit perzisztencia-hossznak nevezünk. Így a tiszta DNS minden további tényező nélkül lényegében kondenzálódik; hőegyensúlynál, véletlenszerű tekercsformát vesz fel. Az E. coli kromoszóma DNS véletlenszerű tekercse (1B. Ábra) ~ 523 μm3 térfogatot (4/3 π r3) foglalna el, a gyrációs sugárból számítva (Rg = (√N a) / √6), ahol a a Kuhn-hossz (2x perzisztencia-hossz), és N a Kuhn-hosszúságú szegmensek száma a DNS-ben (a DNS teljes hossza elosztva a-val). Bár a DNS már véletlenszerű tekercs formájában kondenzálódott, még mindig nem tudja feltételezni a nukleoid térfogatát, amely kisebb, mint egy mikron (1C. Ábra). Így a DNS eredendő tulajdonsága nem elegendő: további tényezőknek kell elősegíteniük a DNS kondenzálódását ~ 103 nagyságrendben (a véletlen tekercs térfogata osztva a nukleoid térfogatával). A nukleoidképződés második lényeges aspektusa a DNS funkcionális elrendezése. A kromoszómális DNS nemcsak kondenzált, hanem funkcionálisan is szerveződik oly módon, hogy kompatibilis legyen a DNS-tranzakciós folyamatokkal, például a replikációval, a rekombinációval, a szegregációval és a transzkripcióval (1C. Ábra).
Csaknem öt évtizedes, 1971-ben kezdődő kutatás [1] kimutatta, hogy a nukleoid végső formája a DNS hierarchikus szerveződéséből származik. A legkisebb méretben (1 kb vagy kevesebb) a nukleoidokkal társított DNS építészeti fehérjék kondenzálják és rendezik a DNS-t a DNS hajlításával, hurokba kapcsolásával, áthidalásával vagy burkolásával. Nagyobb skálán (10 kb vagy nagyobb) a DNS plektonémiás hurkokat képez, a DNS fonott formáját, amelyet szupertekercselés indukál. A megabázis skálán a plektonémiás hurkok hat térben szervezett doménné (makrodomén) egyesülnek, amelyeket az azonos makrodoménen belüli DNS-helyek közötti gyakoribb fizikai interakciók határoznak meg, mint a különböző makrodomének [7]. A makrodoméneken belül és között létrejött hosszú és rövid hatótávolságú DNS-DNS kapcsolatok hozzájárulnak a kondenzációhoz és a funkcionális szerveződéshez. Végül a nukleoid egy spirál alakú ellipszoid, amelynek hossztengelyén erősen kondenzált DNS-régiók vannak [8–10]. Az alábbiakban a nukleoid ezen szervezeti jellemzőit és molekuláris bázisát tárgyaljuk.
Főbb fogalmak:
Az E. coli a gének klónozásának előnyös gazdája, mivel a DNS-molekulák sejtekbe történő bejuttatása nagy hatékonyságú.
Az E. coli a fehérjetermelés szempontjából előnyös gazdaszervezet gyors növekedése és a fehérjék nagyon magas szintű expressziójának képessége miatt.
Bakteriális konjugációval nagy DNS-fragmenseket lehet átvinni egyik baktériumról a másikra.
Az E. coli a fágbiológia tanulmányozásakor előnyös gazdaszervezet, nukleinsav- és fehérje-bioszintetikus útjainak részletes ismerete miatt.
Az E. coli azon képessége, hogy kémiailag meghatározott táptalajon növekedjen, kiterjedt genetikai eszköztárával együtt, kulcsfontosságú rendszerré teszi a baktériumok anyagcsere útjainak tanulmányozásában.
DNS klónozása homológ rekombinációval Escherichia coliban
Absztrakt
Az idegen DNS klónozása az Escherichia coli episzómákban a molekuláris biológia sarokköve. Az 1970-es évek elején végzett úttörő munka, amely DNS-ligázok felhasználásával illesztette be a DNS-t episzómális vektorokba, továbbra is a legszélesebb körben alkalmazott megközelítés. Itt egy másik elvet írunk le, az 1. , 2. rekombináció ET felhasználásával az irányított klónozáshoz és szubklónozáshoz, amely számos előnyt kínál. Legfőképpen egy kiválasztott DNS-régió előzetes izolálás nélkül klónozható egy komplex keverékből. Ezért az ET rekombinációval történő klónozás hasonlít a PCR-re, mivel mindkettő két kiválasztott pont közötti DNS-régió amplifikációját foglalja magában. A stratégiát a kiválasztott DNS-régiók szubklónozására alkalmazzuk több, E. coliban rezidens célmolekulából gazdasejteket, és a kiválasztott DNS-régiókat klónozni a genomi DNS-készítményekből. Itt elemezzük a megközelítés alapvető szempontjait, és számos példát mutatunk be, amelyek szemléltetik annak egyszerűségét, rugalmasságát és figyelemre méltó hatékonyságát.
