LEÍRÁS A gyöngy- és oszlopalapú elválasztási módszerek nagyban támaszkodnak az affinitásmegkötő rendszerek sebességére és könnyűségére. A ligandumokat, például a sztreptavidint, az antitesteket és a lektineket mind a specifikusan jelölt célpontok befogására, mind a ligandumkötő partneret természetesen expresszáló sejtek és biomolekulák izolálására használják. A növényi lektinek, például a Concanavalin A (Con A) egyedülálló szacharidkötő tulajdonságai hasznosgá tették őket a szérumban és a sejtlizátumban lévő glikánprezentáló sejtek és glikoproteinek jelölésére és izolálására. A lektineket emellett a sejtek adhéziós vizsgálataiban, a limfociták aktiválására és a szénhidrát alapú terápiák feltárására használták. A Con A-val bevont BioMag Plus mikrorészecskék kényelmes módszert kínálnak a mannosil- és glükozil-tartalmú glikoproteinek és poliszacharidok szérum- vagy sejtlizátumból történő izolálására , vagy más lektin / glikán-közvetített folyamatok vizsgálatára. A BioMag Concanavalin A-t a CUT & RUN-hoz is használták , amely egy kromatinprofil protokoll, amelynek számos fő előnye van a ChIP-hez képest. (lásd a hivatkozásokat)
concanavalin a cona
JELLEMZŐK A
konkanavalin A (Con A) kovalensen kapcsolódik a funkcionalizált BioMag®Plus
részecskékhez, szérum- és sejtkivonatokból származó glikoprotein-izolációkban történő alkalmazásra.
A Con A egy 104 000 Da fehérje, amely négy azonos alegységből áll, és
aktív dimerként vagy tetramerként létezik a pH-tól függően. Szénhidrátkötése
a partnerek az α-D-glükóz és az α-D-mannóz, a
C-3, C-4 és C-6 nem módosított OH-csoportjaival , valamint a fehérjék és peptidek terminális glükózmaradékával.
A Con A agglutinálja a vörösvértesteket (RBC), kölcsönhatásba lép az immunglobulin
glikopeptidekkel és limfocita mitogén. Megköti néhány baktériumot.
Con A kötődést fémionok közvetítik, amelyek stabilizálódnak a konformációban. Minden
kötési helyhez kalcium- és mangánionok szükségesek, és az EDTA-val
vagy más fém-kelátképzőkkel ellátott pufferek használata a szénhidrát-kötő képesség elvesztését eredményezi.
Átlagos átmérője: ~ 1,0 jim
Koncentráció: 5 mg / ml
Con A-Bound: meghatározva A280 ANYAG
szállított anyagoknak
3 ml vagy 10 ml Con A bevont részecskék 10 mM PBS-ben 0,1% nátrium-azidot
szükséges anyag
1,5 ml vagy 2 ml-es mikrocentrifuga csövekbe
emlős szérumproteinek: 0,4 ml 1:20 hígítás PBS / vizsgálati
kötőpuffer: 1x PBS + 0,1% NaN3
+ 1 mM MgCl2
+ 1 mM MnCl2
+ 1 mM CaCl2
(pH 7,4)
Mosópuffer: 1x PBS + 0,1% NaN3
+ 1mM MgCl2
+ 1mM MnCl2
+ 1mM CaCl2
(pH 7,4) + 0,1% Tween® 20
Con A részecske-elúciós puffer: 5mM Tris (pH 8,0) ) + 0,15 M NaCl + 0,05% SDS + 1 M glükóz
Precíziós pipetta eldobható hegyekkel 20-200µL, 200-1000µL adagolására
Mikrocentrifuga csőelválasztó: 1,5 ml mágneses szeparátor (LS001 katalógusszám) BioMag Multi-6 mikrocentrifuga csőelválasztó (MS002 katalógusszám)
Vortex keverő és csőforgató .
concanavalin a
ELJÁRÁS A kutatóknak javasoljuk, hogy optimalizálják a részecskék felhasználását bármely alkalmazásban. 1. Készítsen 0,4 ml szérum mintát 1:20 arányú hígítással 10 mM PBS-sel. 2. Tegyen 1 ml BioMag®Plus Con A részecskét egy tiszta mikrocentrifuga csőbe. Helyezze a csövet egy mágnesre, hogy elválassza a részecskéket az oldattól. Óvatosan távolítsa el és dobja el az oldatot. 3. Mossa meg a részecskéket 1 ml kötőpuffer hozzáadásával. Jól összekeverni. 4. Ismételje meg a részecskemosást még egyszer. Az utolsó mosás után távolítsa el a felülúszót.
5. Adjon hozzá 0,1 ml kötőpuffert az 1. lépésből származó szérummintához. Adja hozzá a mintát a részecskékhez, és inverzióval vagy örvényléssel alaposan keverje össze a részecskék újraszuszpendálásához. 6. Helyezze a mintát egy csőforgatóra, és keverje szobahőmérsékleten 10-30 percig. 7. Vegye ki a mintát a forgórészből, és helyezze egy mágneses szeparátorba. Óvatosan távolítsa el a megtisztított felülúszót. 8. Mossa meg a részecskéket 0,5 ml mosópuffer hozzáadásával. Keverje jól megfordítással vagy örvénykeveréssel. 9. Ismételje meg a 7-8. Lépést. Szuszpendáljuk újra a részecskéket 0,5 ml mosópufferrel, és tegyük 5 percre a cső rotátorára. 10. Ismételje meg a 7–9. Lépést. 11. Helyezze vissza a részecskék csövét a mágneses szeparátorra, és óvatosan távolítsa el / dobja el a felülúszót. 12. Adjon 250 µL eluáló puffert a részecskékhez. Keverje össze a csövet a részecskék újraszuszpendálásához, és helyezze a csövet szobahőmérsékleten 10-30 percig a forgórészre. 13. Helyezze vissza a részecskék csövét a mágneses szeparátorra, óvatosan távolítsa el az eluátumot, és töltse át egy tiszta mikrocentrifuga csőbe későbbi felhasználás vagy tárolás céljából. 14. Ismételje meg a 12-13. Lépéseket. Az eluátumokat egyesíthetjük és kicsaphatjuk. Az eluátumokat jégen tárolja azonnali felhasználás céljából, vagy fagyassza le tartós tárolás céljából. MEGJEGYZÉSEK • Kerülje a reagensek EDTA-val vagy más fémkelátképzőkkel történő használatát, mivel ez csökkenti a kötőpuffer hatékonyságát. • Az érzékeny glikoproteinek izolálásakor proteázinhibitorok alkalmazhatók. • Alacsony glikoprotein-visszanyerés kapcsolható az eluálási inkubációs idő 10 percen túli megnövelésével és / vagy a részecskék 200 µl SDS-PAGE mintapufferben való forralásával 5 percig, majd mágnesesen elválasztva a részecskéket az eluátumtól. (Megjegyzés: A forralás leválaszthat néhány lektint, és nem specifikusan kötött fehérjéket is felszabadíthat.) • Futtasson eluátummintákat SDS-PAGE 4-20% -os trisz-glicin elektroforézis gélen, és festse meg a glikoprotein sávokat a GlycoGel Stain Kit segítségével (Polysciences ‘Catalog Code 24693) vizualizálására. • A GlycoGel festés után festse meg a gélt a Coomassie G250 (1 ml vagy 2 ml 0,5% Coomassie G250 50% metanolban és 10% ecetsavban) alkalmazásával, hogy megjelenítse a többi fehérje sávot. • Az albumin és az IgG eltávolítása a szérummintákból javíthatja az alacsony koncentrációjú glikoproteinek izolálását. Kívánt esetben használja a BioMag® ProMax Albumin eltávolító készletet (katalógus kód BP658) és / vagy a BioMag® ProMax szérum IgG eltávolító készletet (BP659 katalógus kód).
